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色谱柱的维护与再生
色谱柱的维护
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱：
1、色谱柱维护的注意事项很多，第一：请参考说明书
2、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度和压力的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；因此在调节流速时应该缓慢进行。
3、一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
4、选择使用适宜的流动相，以避免固定相被破坏。
5、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者（并且）在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱可以而且应该经常更换。
6、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质，如甲醇。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右。
7、避免使用高粘度的溶剂作为流动相；
8、实验完毕应将柱子冲洗干净；
9、严格控制进样量，不要超载；
11、每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。
12、装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。
13、色谱柱存在pH稳定范围，在使用过程中尽量不超过该色谱柱的pH范围。
14、绝对禁止将缓冲液留在柱内过夜
15、反相柱不能用纯水长时间冲洗。
16、不建议拆开柱子，自己更换填料。
色谱柱的保护
色谱柱在吸附样品时，样品中所含有的盐、脂质、疏水蛋白质和其它一些生物物质都有可能与色谱柱发生相互作用，一些保留值较小的物质如盐类比较容易被冲出色谱柱，而一些保留性较强的组分，流动相溶液不足以把这些物质洗脱下来，多次上样后，这些吸附在柱子表面的物质通常就会积累在柱头。当这些被吸附的样品成分累积到一定程度足以使之形成新的固定相而改变分离机理，以致样品保留时间会波动，会出现拖尾现象。
为了延长色谱柱的使用寿命，前面已经指出，应在分析柱前连接一个小体积的保护柱。保护柱通常填充和分析柱相同的填料(固定相)，可看作是分析柱的缩短形式，安装在分析柱前。其作用是收集、阻断来自进样器的机械和化学杂质，以保护和延长分析柱的使用寿命。一只1cm长的保护柱就能提供充分的保护作用。若选用较长的保护柱，可降低污染物进入分析柱的机会，但会引起谱带扩张。因此选择保护柱的原则是在满足分离要求的前提下，尽可能选择对分离样品保留低的短保护柱。
保护柱也可装填和分析柱不同的填料，如较粗颗粒的硅胶(10～15 μm)或聚合物填料，但柱体积不宜过大，以降低柱外效应的影响。保护柱装填的填料较少，价格较低，其为消耗品，通常可分析50～100次样品，柱压力降呈现增大的趋向就是需要更换保护柱的信号。现在市场供应可更换柱芯式设计的保护柱，由保护柱套和可更换式保护柱芯两部分组成。
保护柱与分析柱的连接示意图
1-保护柱套；2-保护柱芯；3-PEEK标准通用接头；4-分析柱接头；5-连接六通进样阀接头
色谱柱的保存
硅胶、氧化铝或正相键合相柱，应保存在流动相中。氰基柱不能保存在纯有机溶剂(如甲醇或乙腈)中，应保留在欲使用的流动相中；氨基柱最好保存在乙腈中，而非流动相，并且应注意不可使用丙酮作流动相。
反相柱应保存在纯甲醇溶剂中，对填充高交联度苯乙烯-二乙烯基苯共聚微球的非极性固定相也可用此法保存。
色谱柱的再生
对使用时间较长、柱效逐渐下降的色谱柱，可用下述方法进行快速再生，以除去微量不洁杂质在柱头的聚积，不同的色谱柱清洗方法各不相同：
正相柱：依次以20～30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。
反相柱：用极性溶剂每种30mL，按以下顺序清洗：5％-10%甲醇水溶液、0.5mol/L H3PO4(或0.1mol/L EDTA钠盐)、5％甲醇水溶液、甲醇、甲醇-氯仿(1：1)混合液、甲醇、5％甲醇水溶液，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积。最后保存在甲醇溶剂中。
离子交换色谱柱：长时间在缓冲溶液中使用和进样,将导致色谱柱离子交换能力下降。用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生,反之,用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生。另外，还可以选择能溶解柱内污染物的溶剂为流动相做正方向和反方向冲洗。但再生后的色谱柱柱效是不可能恢复到新柱的水平的。
当色谱柱的性能变得很差时，可采用下述两种方法，作最后的补救：
1，修补柱头并同时更换不锈钢烧结片。当取下烧结片发现柱头塌陷或填料被杂质污染时，可挖掉0.5mm左右的固定相，再重新填充同样的干燥固定相，用少量流动相润湿，再填充干燥的固定相与柱口平齐(必要时用光滑的不锈钢棒压紧)，如此重复3～5次。再换上新的不锈钢烧结过滤片，拧紧结头，与高压泵连接，用流动相冲洗20min，若柱压力降恢复正常，可连接检测器，测柱效。若柱效恢复就可继续使用。若柱压力降恢复正常，但柱效仍偏低，表明柱头未填充紧密，仍有空隙，此时应重复上述操作，直至柱压力降恢复正常、柱效也恢复正常才可继续使用。
2，倒冲色谱柱。此法适用于已修补过柱头，柱寿命已达中后期的色谱柱。柱逆向使用后柱效会损失较大(约30％)，倒冲柱可检查柱头不锈钢烧结片是否堵塞。若已堵塞在倒冲柱时，可观察到柱压力降减小，待柱压力降恢复正常，再将色谱柱按原方向安装使用。
由中国石油和化工网机械设备编辑部整理
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