和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由固定相和流动相组成，这里主要讲一下固定相，也就是色谱柱填充物。
一、固定相：
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。
刚性固体：以二氧化硅为基质，可承受7.0×108~1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，泛用性极强。
硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类：
1.表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小、柱效高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，大允许量受到限制。
2.全多孔型固定相
由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（5~10um），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
二：色谱柱基质选择：
1.硅胶基质：
1.1反相色谱柱：
反相色谱填料常是以硅胶为基础，所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。
1.2正相色谱：
正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica)，以及其他具有极性官能团，如胺基团(NH2,APS)和氰基团(CN，CPS)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等。
1.3离子交换色谱柱：
主要是以磺化交联强阴/阳离子键合硅胶色谱柱，常用规格：强阴离子色谱柱(SAX)，强阳离子交换色谱柱(SCX)
2.聚合物基质：
聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～14均可使用。相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成的高聚物，聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质。因此，聚合物基质广泛用于分离大分子物质。
3.其他无机填料
其它HPLC的无机填料，由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。
氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。
但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制；新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH范围1～14，温度可达100℃，其重要用途与优势尚在进行中。
一句话选择：硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物质，主要用来制成分子排阻和离子交换柱。
色谱柱尺寸的选择：
| 应用目标 | 柱内径（mm） |
| 极高灵敏度，LC/MS,多肽和蛋白质 | 0.1,0.075 |
| 极高灵敏度，样品有限，LC/MS,多肽和蛋白质 | 0.3，0.5 |
| 高灵敏度，样品有限，LC/MS | 1.0 |
| 节省溶液，特殊的低体积仪器 | 2.1 |
| 特殊检测仪，如质谱仪 | 2.1 |
| 高灵敏度，样品有限 | 2.1 |
| 节省溶液，标准的HPLC，LS/MS | 3.0 |
| 标准分离 | 4.6 |
| mg级制备性分离 | 9.4 |
| 0.1~1g制备性分离或半分离 | 21.2 |
| ~100g制备性分离 | 30,50 |
| 中试和生产 | 100~1000 |
三、流动相：
对流动相溶剂的要求是：
1.溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。
2.溶剂与检测器匹配。
3.纯度高：色谱纯及以上。
4.化学稳定性好
5.低粘度：若使用高粘度溶剂，色谱系统压力增高，不利于分离。
常用的低粘度溶剂：丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。
四、检测器：
选用的检测器应该清晰的区别流动相与被检测物质。
五、进样器
除了一些实验室的样品较少以外需要手动进样以外，现在一般选择自动进样器。